Criação de uma metodologia para termoestabilização de proteínas via mutagenese in silico e aplicação em uma enzima da classe das endoglucanases
Fecha
2022-09-30Metadatos
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A busca por métodos mais sustentáveis de produção industrial, fez com que enzimas se tornassem um alvo interessante para o uso em diversas industrias, como a produção de biocombustíveis. Além de serem mais sustentáveis do que reações químicas tradicionais, enzimas também são capazes de catalisar reações que não são possíveis com estes métodos. Entretanto, um dos problemas no seu uso em aplicações industriais é a sua sensibilidade quanto às condições do meio, sendo processos industriais muitas vezes conduzido em condições adversas à estabilidade da enzima. Um dos métodos que pode ser utilizado para contornar esse problema é a engenharia de proteínas, onde aminoácidos da proteína são modificados de forma a melhorar características específicas de sua estrutura e função. No presente trabalho, uma metodologia in silico foi desenvolvida para predizer mutações pontuais que tenham alto potencial de aumentarem a termoestabilidade de uma proteína. A metodologia começa com uma limpeza do alvo utilizando o programa PyMol, seguido da seleção dos resíduos a serem mutados pelo programa YASARA. Em seguida, uma mutagenese de saturação é feita em todos os resíduos selecionados pela abordagem FRESCO, e os programas FoldX e Rosetta_ddG. Os resíduos preditos como estabilizantes por estas ferramentas são então submetidos a simulações de backrub e abordagem de sequence tolerance utilizando a ferramenta Rosetta. As mutações são então submetidas a simulações de dinâmica molecular por 100 nanosegundos, e os resultados da análise de RMSF, número de pontes de hidrogênio e raio de giro comparados com a proteína nativa. Para teste, a enzima degradadora de celulose da classe das endoglucanases Xaccel5A foi utilizada como modelo. Duas mutações foram selecionadas, e a proteína nativa e as duas mutações foram expressadas e testadas in vitro nas temperaturas de 40ºC, 50ºC e 60ºC via ensaio de DNSA. Os resultados mostraram a capacidade da metodologia de produzir uma lista resumida de mutações com grande potencial de estabilização em um tempo hábil curto. Das duas mutações testadas, uma delas se mostrou como tendo desempenho superior à proteína nativa em todas as temperaturas. Entretanto, mais estudos são necessários para melhor caracterizar a cinética enzimática das mutações, assim como testes com intervalos de temperatura ampliados.