Estudo de genes de referência em Zebrafish (Danio rerio) transgênicos superexpressando o hormônio do crescimento
Resumo
A PCR quantitativa em tempo real é uma das mais importantes técnicas na análise da expressão gênica e tem como pré-requisito o uso de genes de referência. Esses genes têm por função, normalizar os dados da reação, possuindo papel importante no desfecho dos resultados e sucesso da análise. Os genes de referência devem possuir expressão significativa e estável nos tecidos em todas as condições experimentais. Para o modelo animal zebrafish (Danio rerio) esses genes vêm sendo estudados, entretanto para os modelos transgênicos dessa espécie até onde sabemos, não há estudos neste sentido. O zebrafish gh-transgênico faz parte de uma linhagem denominada F0104, desenvolvida com o hormônio do crescimento oriundo do peixe-rei marinho (Odonthestes argentinensis). Pressupondo-se que o processo de transgenia possa influenciar os níveis de expressão de genes comumente utilizados como normalizadores, levando à necessidade de se validar genes de referência específicos para estudos de expressão gênica em zebrafish transgênicos. Nesse contexto, o objetivo do presente trabalho foi analisar a estabilidade dos genes actb1, actb2, atp1a, b2m, eif2b, ef1α, igf1, gapdh, rpl2, rpl7, rpl13α, tuba, e 18s em diferentes tecidos de zebrafish transgênicos e não transgênicos, a fim de avaliar o seu potencial uso como genes de referência. Para tal, animais adultos, de ambos os sexos, gh-transgênicos (n=21) e não transgênicos (n=21), constituíram os grupos experimentais. Amostras de fígado, cérebro, intestino e musculatura foram coletadas. A cada três amostras de cada órgão coletado, um pool foi confeccionado, totalizando sete pools. Após as etapas de extração de RNA, síntese de cDNA e real-time qPCR, foram realizadas as análises com os softwares Ct, GeNorm, NormFinder, BestKeeper e RefFinder. Os resultados demonstraram que independentemente do tipo de tecido coletado, os genes mais estáveis para o grupo gh-transgênico, foram rpl13α, ef1α, rpl7e rpl2, enquanto os menos estáveis foram os genes gapdh, 18s e tuba. A partir dos dados obtidos, verificou-se, que o tecido que mais influenciou na instabilidade dos genes foram o intestino e o fígado entre os grupos analisados. Este estudo evidenciou ainda, que mesmo genes considerados constitutivos e comumente utilizados como normalizadores em estudos feitos com zebrafish selvagem, tais como gapdh, 18s e tuba, sofreram variações entre os diferentes tecidos, tanto de animais transgênicos quanto em não transgênicos. Por fim, concluem-se que os genes rpl13α, ef1α, rpl7 e rpl2 possuem alta estabilidade, sendo possível sua utilização como genes de referência em estudos envolvendo análise de expressão gênica em zebrafish (Danio rerio) gh- transgênicos e que claramente, os genes como gapdh, 18s e tuba possuem baixa estabilidade e, portanto, não são adequados como genes de referência para os grupos e tecidos estudados.