Desenvolvimento de Testes Imunoquímicos e Moleculares para o Diagnóstico da Leptospirose
Resumo
A Leptospirose é uma zoonose de ocorrência mundial causada por bactérias do
gênero Leptospira. As manifestações clínicas da leptospirose são similares a outras
doenças febris e este fato frequentemente atrasa o diagnóstico e o início do
tratamento. Portanto, o diagnóstico precoce e acurado da doença é um prerequisito
para o tratamento adequado. Sorovares patogêncios de Leptospira possuem uma
grande variação antigência e esta diversidade é atribuída principalmente ao
lipopolissacarídeo presente na membrana externa. Contrastando com esta
característica, antígenos conservados de sorovares patogênicos são principalmente
representados por proteínas de membrana externa. Recentemente foi comprovada a
exposição da proteína LipL32 na superfície da membrana externa de leptospiras
patogênicas. Neste estudo, LipL32 em sua forma recombinante (rLipL32) foi utilizada
para imunizar camundongos BALB/c e produzir anticorpos monoclonais (mAbs). Três
mAbs contra rLipL32 foram produzidos e caracterizados quanto ao seu potencial
para uso em testes diagnósticos usando diferentes metodologias. Os mAbs foram
conjugados à peroxidase e avaliados quanto a reação com proteina nativa em
células de leptospiras íntegras e rompidas, conjugados com isotiocianato de
fluoresceína (FITC) para uso em imunofluorescência para marcar células de
leptospira intactas e tratadas com metanol, e usados para imunoprecipitar células de
leptospira. Os anticorpos monoclonais anti-LipL32, utilizados em ELISA tanto
conjugados com peroxidase ou como anticorpo primário, ligaram-se às células de
leptospiras intactas ou rompidas pelo calor, provando que podem ser usados em
testes imunoenzimáticos para detecção da proteína nativa. Na imunofluorescência,
os mAbs foram capazes de marcar células da bactéria tanto intactas como fixadas
com metanol. Dois mAbs foram capazes de imunoprecipitar proteina nativa de
leptospiras vivas e móveis, e quando adsorvidos em partículas magnéticas foram
capazes de capturar bactérias para amplificação por PCR. Na seqüência deste
estudo, o mAb 1D9 foi utilizado em estudos de padronização da metodologia de
imunoseparação magnética associada a PCR (IMS/PCR) para diagnóstico de
leptospirose. O anticorpo 1D9 foi adsorvido em partículas magnéticas e utilizado
para capturar leptospiras em soro e urina humanas artificialmente contaminadas
com leptospiras para posterior amplificação. Para assegurar a acurácia da PCR foi
construído um controle interno de amplificação (IAC) específico para a metodologia
desenvolvida utilizando como alvo sequências de primers já padronizados para
exclusiva amplificação de leptospiras patogências e uma sequencia de DNA não
relacionada. A metodologia de IMS/PCR IAC permitiu usar somente um par de
primers na reação de PCR e mostrou ser promissora para diagnóstico de
leptospirose, pois foi capaz de detectar 102 células por mL em amostras de soro e
urina artificialmente contaminadas, correspondendo a amplificação a partir de
aproximadamente 25 cópias do genoma. Os resultados obtidos evidenciam uma
nova perspectiva no diagnóstico da leptospirose através da utilização da proteína
LipL32 em métodos imunoquímicos e moleculares ou pela associação destas
metodologias. A metodologia de imunoseparação com o mAb anti-LipL32 pode ser
utilizada previamente a amplificação de outros alvos do genoma bacteriano por
PCR, já que ela possibilita a separação e concentração exclusiva de Leptospira
patogênica.