Produção e caracterização de proteínas recombinantes de Mycoplasma hyopneumoniae com potencial para uso em imunodiagnóstico e vacinação
Abstract
Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína (PES),
uma doença respiratória responsável por significativas perdas econômicas. Vacinas
comerciais são mundialmente utilizadas no controle desta doença, porém
proporcionam apenas proteção parcial. Além disso, são caras devido ao crescimento
fastidioso do M. hyopneumoniae in vitro. Desta forma, o desenvolvimento de
alternativas para a profilaxia da PES é fundamental para a melhoria da sanidade dos
suínos. A tecnologia do DNA recombinante pode ser usada para superar problemas
com as vacinas convencionais. No entanto, pela utilização de códons TGA e não
TGG para codificar o amino ácido triptofano, a tradução de genes de micoplasmas
termina prematuramente quando clonados e expressos em outras bactérias, como
Escherichia coli. Devido a isso, o número de proteínas antigênicas de M.
hyopneumoniae caracterizadas e testadas como vacinas ou em testes de
imunodiagnóstico ainda é restrito. Neste trabalho, 63 fragmentos gênicos foram
selecionados, os quais correspondem a 48 seqüências codificadoras (CDS) de M.
hyopneumoniae. Num primeiro momento, foi padronizado um método de PCR de
sobreposição para mutagênese sítio-dirigida de genes de M. hyopneumoniae,
objetivando a substituição do códon TGA por TGG, na seqüência do DNA. Com esse
método, a mutagênese sítio-dirigida foi realizada com sucesso em 14 genes de M.
hyopneumoniae. Os demais genes selecionados foram amplificados por PCR e
clonados no vetor Champion pET200D/TOPO®. No total, 59 fragmentos gênicos
foram clonados eficientemente. Destes, 49 tiveram suas proteínas expressas em E.
coli e 35 foram purificadas por cromatografia de afinidade em coluna de Ni-
Sepharose (HisTrap ). As propriedades antigênicas e imunogênicas destas
proteínas foram analisadas. Para isso, as proteínas foram testadas contra soro de
suínos convalescentes e soro hiperimune através de ELISA (enzyme-linked
immunosorbent assay) e Western blot. Dezenove proteínas recombinantes foram
reconhecidas especificamente por soro de suínos convalescentes, indicando que
elas são expressas durante a infecção. Resposta imune humoral contra as proteínas
recombinantes foi avaliada em camundongos BALB/c através de ELISA. Os
resultados demonstraram que os antígenos induzem um nível variável de anticorpos,
o que nos permite inferir quanto à capacidade imunogênica de cada antígeno. O
soro dos camundongos inoculados com 20 proteínas foi capaz de reconhecer as
proteínas nativas através de ELISA. Este estudo permitiu identificar e caracterizar
novas proteínas imunogênicas de acordo com o seu potencial para uso em testes de
diagnóstico e/ou vacina. Estes dados representam uma importante contribuição para
o desenvolvimento de testes sorológicos mais efecientes e vacinas de subunidade
para o controle da infecção causada por M. hyopneumoniae em suínos.