Anticorpos Monoclonais contra Listeria spp.: Produção, Caracterização e Aplicação em Métodos Diagnósticos
Fecha
2011-12-01Metadatos
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Os métodos convencionais empregados para detecção de Listeria monocytogenes
em alimentos são laboriosos e onerosos, requerendo vários dias para sua
identificação final. A utilização de anticorpos monoclonais (MAbs) em imunoensaios
para detecção rápida de bactérias tem como vantagem a alta especificidade e
rapidez, principalmente quando direcionados para fatores de virulência conservados.
Dentre os diversos fatores de virulência de Listeria, a proteína de membrana
internalina A (InlA), é umas das mais bem caracterizadas, sendo um excelente alvo
por ser altamente exposta na superfície e exclusiva de espécies patogênicas. Neste
trabalho é relatado a produção, caracterização e utilização em métodos de
diagnósticos de um painel de MAbs contra a InlA (2D12, 3B7, 4E4), e de um MAb
(3F8) que reconhece especificamente todas as bactérias do gênero Listeria. Na
produção dos MAbs, camundongos BALB/c foram imunizados com uma proteína
recombinante InlA (rInlA) concomitantemente com L. monocytogenes inativadas por
fervura. Os MAbs gerados demonstraram excelente reatividade por ELISA indireto,
Western blot e imunofluorescência. O MAb anti-InlA 2D12 marcado com Cy5 foi
usado como anticorpo de detecção de L. monocytogenes, no sistema tipo sanduíche
de sensor de fibra óptica. Usando MAb-2D12 como anticorpo de captura nas fibras
ópticas, obteve-se um limite de detecção de ~3 x 102 CFU.mL-1, e um limite de
detecção de ~1 x 105 CFU.mL-1 foi visualizado com MAb-3F8 como captura. Os
MAbs anti-InlA 2D12 e anti-Listeria 3F8 foram posteriormente utilizados para
sensibilizar esferas paramagnéticas e testados na separação imunomagnética (IMS)
de L. monocytogenes em culturas puras, e em queijo e salsichas tipo hotdog
artificialmente contaminados. Após a captura por IMS, as bactérias foram liberadas,
incubadas com a fibra óptica ou plaqueadas em agares para contagem. Em paralelo,
a confirmação da captura de L. monocytogenes foi realizada por PCR quantitativo
em tempo real e por light-scattering technology (BARDOT). Utilizando IMS para
separar e concentrar L. monocytogenes, seguido da utilização em plataforma de
fibra óptica, foi possível realizar a detecção em menos de 22 horas, de
aproximadamente 40 UFC/g de L. monocytogenes em presença de L. innocua, em
queijo e salsicha artificialmente contaminados. Além disso, a proteína alvo do MAb3F8
foi identificado como frutose 1,6-bifosfato aldolase através de espectrometria de
massa (MALDI-TOF-MS). Os resultados obtidos nesse trabalho indicam que a
utilização em conjunto dos sistemas de IMS e fibra óptica com os MAb-2D12 e MAb3F8,
foram confiáveis e rápidos, e assim, podendo ser empregados em
imunoensaios de rotina para detecção de L. monocytogenes em alimentos. Contudo,
ambos MAbs possuem ainda grande potencial para serem mais explorados em
outras plataformas de biossensores, assim como, em outros imunoensaios de
detecção e funcionalidade de InlA e FBA em Listeria