Transferência gênica mediada por espermatozoides através de eletroporação capilar em zebrafish Danio rerio
Abstract
A transferência gênica mediada por espermatozoides (SMGT) é uma biotecnologia promissora para transgênese em espécies aquáticas, baseada na capacidade natural dos espermatozoides serem portadores espontâneos de DNA exógeno. Porém, ainda possui alguns entraves, o que torna necessário implementar estratégias para otimizar a técnica da SMGT. Métodos físicos, como a eletroporação, têm sido utilizados para melhorar a eficiência de absorção de DNA nos espermatozoides, mas ainda a eletroporação convencional apresenta alguns efeitos negativos sobre a viabilidade celular. Assim, sistemas alternativos de eletroporação, como a eletroporação capilar podem ser explorados para a transfecção de células espermáticas, a qual tem demonstrado eficácia muito alta, com alta taxa de transfecção, sendo rápida, reprodutível e possuindo baixo índice de perda celular. O objetivo deste estudo foi validar um método de eletroporação capilar eficiente para incorporação de DNA em espermatozoides de Zebrafish Danio rerio. A eletroporação capilar foi realizada em dois grupos distintos (com e sem DNA exógeno) usando cinco diferentes voltagens: 500V, 750V, 1000V, 1250V e 1500V. Parâmetros cinéticos foram determinados usando análise computadorizada de sêmen, enquanto a integridade da membrana, fluidez da membrana, funcionalidade mitocondrial, índice de fragmentação de DNA, concentração de espécies reativas de oxigênio (ROS), peroxidação lipídica na membrana plasmática (LPO) e absorção de DNA foram avaliadas por citometria de fluxo. Os resultados revelaram que todos os grupos eletroporados demonstraram percentagens significativamente maiores de espermatozóides transfectados quando comparados ao grupo controle (P <0,05). Grupos eletroporados em altas voltagens (1000V, 1250V e 1500V) demonstraram efeitos negativos na integridade da membrana celular, quando comparados a outros grupos e controle. As maiores tensões (1250V e 1500V) reduziram 50% da duração de motilidade, quando comparadas ao grupo controle sem DNA. A eletroporação com maiores voltagens, como 1000V, 1250V e 1500V, levou a um aumento de 45% na concentração de espécies reativas de oxigênio nas células espermáticas (P <0,05), enquanto as menores voltagens (500V e 750V) não diferiram do grupo controle (P> 0,05). A fluidez da membrana e os danos no DNA aumentaram com o aumento da voltagem. A funcionalidade mitocondrial espermática foi a única, entre os parâmetros não cinéticos, apesar das diferentes tensões, que não apresentou resposta negativa após a eletroporação (P> 0,05). Sob a recomendação do uso de tensões de até 750 V, com otimização de 25% de taxa de transfecção, este método representa uma alternativa segura e eficiente para a eletroporação de espermatozóides de Zebrafish Danio rerio.