Produção e imobilização covalente da inulinase obtida a partir de microrganismos isolados de frutos nativos da região Amazônica (Colômbia)
Resumo
As inulinases são β-frutosidases inespecíficas que hidrolisam a inulina em
frutooligossacarídeos (FOS), frutose e um pouco de glicose. Os xaropes de frutose
são amplamente utilizados como adoçantes na indústria de alimentos. A frutose é
obtida da inulina por uma simples reação enzimática com inulinases que produzem
95% de frutose. O presente trabalho teve como objetivo produzir e caracterizar
inulinases a partir de fungos filamentosos e leveduras isolados e identificados de
polpa de frutos da região Amazônica como: Cupuaçu (Theobroma grandiflorum),
Araçá-boi (Eugenia stipitata McVaugh) e Cubiu (Solanum sessiliflorum). A pesquisa
foi organizada em três capítulos. O Capítulo I aborda uma visão geral de todos os
microrganismos identificados fenotipicamante pelo método API com potencial para
produzir inulinase por fermentação submersa usando inulina (Yacon) como fonte de
carbono e diferentes tempos. A partir dessa avaliação foram escolhidos seis
morfotipos (1, 3, 5, 10, 17 e 21) e o tempo 48 horas como a melhor condição para
produção da enzima. O Capítulo II descreve os métodos de extração de DNA e RNA
para a identificação molecular que foi realizado com os seis morfotipos selecionados
e a transcriptômica do morfotipo No.3 escolhido por sua característica de status
GRAS (seguro). Os microrganismos foram identificados em gênero e espécie
usando a região ITS e 18S do DNAr pelo método SANGER e comparando as
sequências in sílico com outras depositadas na NBCI, usando o programa BLAST. A
expressão dos genes de inulinase foram avaliados a partir de RNA pela tecnologia
de nova geração RNAseq Solexa/Illumina e análises de bioinformática. O Capítulo III
descreve a produção de inulinases apartir do morfotipo No.3 identificado como
Aspergillus niger, usando meios de cultura contendo diferentes fontes de carbono
(M1, M2, M3 e M6), parcialmente purificadas com resina DEAE Sephacel equilibrada
com NaCl 0,25M, imobilizadas em grafeno oxidado (GO), caracterizadas
bioquimicamente e com avaliação em armazenamento a 6 ºC. Na eletroforese SDSPAGE uma banda de proteína com peso molecular em torno de 97 kDa foi
observado. Os melhores resultados foram obtidos usando o meio de cultura M2
contendo inulina para produzir a enzima extracelular, um pH 4,5 e temperatura de 70
ºC, Km igual a 5,2 mg.mL-1 e Vmax de 40 U.mg
-1 para enzima imobilizada, com um
rendimento acima de 80%, sete ciclos de resuso e estabilidade de 34% após 30 dias
de armazenamento em refrigeração (6 ºC).
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